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生物实验:in vivo&in vitro&ex vivo

In vivo,within the living,活体中的In vitro,within the glass,玻璃中的Ex vivo,out of the living,活体外的

image J测量western blot条带灰度值

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Western Blot视频详解

1、Introduction to Western Blotting Part 12、Introduction to Western Blotting Part 23、Introduction to Western Blotting Part 34、Introduction to Western Blotting Part 45、Introduction to Western Blotting Part 56、Introduction to Western Blotting Part 6

引物设计

PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前,PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟,包括聚合酶以及缓冲液的优化,使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样,分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说,整个PCR实验条件,基本可以模板化,而不需每做一个实验都从头开始摸条件。

然而PCR实验中,有一个环节是厂家无法帮我们优化的,那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为例,手把手教各位用最简单的方法,设计用于实时定量PCR研究基因表达水平的引物。在第二部分还会简单介绍,如何用相同的在线工具来评价引物。

(注:本文仅介绍的引物设计方法,仅适用于染料法qPCR之于基因表达定量研究,不涉及其他应用。像ORF克隆,没有特别的方法,就是老老实实在ORF一头一尾设计一对,用DNAStar lasergene等软件可以辅助设计,或者自己手动。而如果要做点突变、插入、删除,或者多片段组装,可以使用NEB相应的在线工具。)


第一部分:用Primer Blast设计引物

首先,上NCBI搜人CRTC1基因。

QQ截图20170329165757.jpg

往下拉,可以看到这个基因可能存在2种转录本。(NM开头的就是mRNA,其他暂时别管)

QQ截图20170329170131.jpg

    继续往下拉,找到各个转录本的具体信息,可以看到isoform 1和3共2个转录本。

QQ截图20170329170355.jpg

    以isoform 3为例,点击NM_001098482.1那个超链接,进入下面这个页面。

QQ截图20170329170700.jpg

    点击右方的Pick Primers,进入引物设计的Primer Blast页面。可以看到PCR Template那里已经帮你填好了。现在,其他地方暂时留空,把PCR product size的Max改成350。qPCR反应中,延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算,30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降,所以保守起见,将最大产物长度设为350 bp甚至更低比较合适。太短也不行,否则跟引物二聚体分不开,所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合适的引物,那就把这个数字往上调,最好别超过500,要不然qPCR的反应条件就得改了(其实也就改延伸时间)。

QQ截图20170329171051.jpg

    接下来,Exon junction span选项改为Primer must span an exon-exon junction。这里的意思是,至少有一条引物跨过了外显子之间的连接处。这样就算有基因组DNA污染了cDNA,也不会被扩增出来,保证定量准确。当然如果有的基因硬是没有内含子,改了这个选项就会报错。

QQ截图20170329171243.jpg

    接下来的选项不用更改。Specificity check默认打钩,帮你跑引物特异性验证。Organism已经帮你自动填了人类(9606是Homo sapien的编号,你想研究其他物种,那就在一开始搜基因的时候搜对应的物种)。最后一行,如果你把钩打上的话,就会允许引物帮你扩增其他isoform(本例中就是isoform 1)。当然,这不代表着会把所有isoform一起扩增,或者说强制一起扩增。如果需要这么做,我们需要返回前面更改一下设置。这一点第一部分的末尾注明。

QQ截图20170329171522.jpg    点击Get Primers按钮,就会帮你设计引物了。由于是在线工具,请耐心等待几十秒。有时候人多,可能需要等几分钟。

QQ截图20170329172009.jpg    很快我们就会看到这个页面,返回了10对引物。按照前面的默认条件,这些引物的退火温度都在60℃左右。

QQ截图20170329172418.jpgQQ截图20170329172636.jpg

    按照这个方法设计出来的引物,我做了那么多基因,成功率基本接近100%。这个在线工具的算法也在不断优化,按照近两三年的使用情况来看,没有遇到过失败的。(尤其是使用比较良心和稳定的试剂。在国内我是用天根,在美国是用原名biotool刚更名为bimake的试剂。好吧你说是软文我也懒得反驳,反正我就用这两家。这里也没有钦定的意思,我也用过Qiagen,Biorad和Thermo的,也能做得很好,但贵。)

    那如果要同时扩增isoform 1转录本,那怎么办呢?很简单,由于不同转录本之间同源性很强,基本上只有5’或者3’端有点差异,因此我们只需要指定引物落在所有转录本的共同区间就行了。

    回到刚开始的页面,我们可以看到另外一个转录本1。后面第4个以后的外显子(就是绿色的小竖线)是所有转录本都完全一致的。也就是说,我们只要让反向引物落在第4个外显子之后,就可以把所有2个转录本一起扩增出来了。

QQ截图20170329170131.jpg

注意:XM开头的不是我们需要的,那些是预测的转录本。

    往下拉,这一例中我们可以随便点击任何一个转录本的NM那个超链接,比如还是isoform 3,进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前,点击Highlight Sequence Features。

QQ截图20170329170700.jpg

    然后你就会看到页面的底下变成了这个模样。我们把高亮的序列设置为exon(Feature左边),并高亮第4个外显子。目测一下,这个外显子从380位碱基开始。记下这个数字。

QQ截图20170329180150.jpg

    回到上方,点击Pick Primers,并把正向引物的5’端边界设为380。注意,不是3’端边界。其他的选项,按照本文前面讲述的方法进行调整。然后点击Pick Primers按钮。

QQ截图20170329193713.jpg

    此时傲娇的程序就会跳出来抗议说,你这样会P出其他的isoform。然而这就是我们要的结果。于是把所有的钩都选上。

QQ截图20170329193907.jpg

    点击Submit,再耐心等一会,就能得到能够扩增所有isoform的引物了。

QQ截图20170329194336.jpg    我们可以看到,10个引物都是至少从第四个外显子后才出现的。

QQ截图20170329194532.jpg    如上图所示,这两个都是我们需要的!

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