点点滴滴

Good Luck To You!

“我爱你”的其他表达方式

周星驰:我养你啊!苏轼:不思量,自难忘。黄伟文:余生请你指教。王家卫:那一刻,我很暖。夏目漱石:今晚月色真美。张学友:很想带你去吹吹风。玛格丽特:我在床上,饭在锅里。范仲淹:酒入愁肠,化作相思泪。李白:郎骑竹马来,绕床弄青梅。张爱玲: 你还不来,我怎敢老去。钱武肃王:陌上花开,可缓缓归矣。方文山:天青色等烟雨,而我在等你。刀郎:自你离开以后,从此就丢了温柔。元稹:曾经沧海难为水,除去巫山不是云。张国荣:就让我陪你唱一辈子戏,不行吗?王小波:你好哇,李银河,见到你真高兴。李之仪:只愿君心似我心,定

UEFI+GPT安装64位windows7

第一步   制作u盘        U盘格式化为FAT32 格式 (UEFI是不支持NTFS), 将msdn的win7 旗舰 64位的 ISO文件解压到 这个U盘上 。第二步     配置EFI文件在EFI文件夹内新建一个Boot文件夹,将 bootmgfw.efi 改名成 BootX64.efi,然后放进这个新建好的文件夹。第三部    配置激活

《陋室铭》,《陋妻铭》,《微信铭》,《交友铭》,《老人铭》

《陋室铭》山不在高,有仙则名。水不在深,有龙则灵。斯是陋室,惟吾德馨。苔痕上阶绿,草色入帘青。谈笑有鸿儒,往来无白丁。可以调素琴,阅金经。无丝竹之乱耳,无案牍之劳形。南阳诸葛庐,西蜀子云亭。孔子云:何陋之有?《陋妻铭》妻不在多,有一则行;貌不在美,有德则灵。虽称拙妻,质朴澄心。早晚抚儿女,朝夕相夫君。往来无是非,谈笑皆正经。可以同患难,共苦辛。无官商之觊觎,无色鬼之调情。生活既寡淡,相貌亦平平;试问君,“谁如你行?”微信铭》路不怕远,有网则近。友不悲疏,有言则亲。斯是微信,任君纵横。消息走千里,

image J测量western blot条带灰度值

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CentOS减小home分区扩大root分区

1、查看分区df -hvgdisplay2、备份/home分区tar cvf /tmp/home.tar /home3、卸载/home分区,如果无法卸载,先终止使用/home分区的进程fuser -km /home/lvremove /home4、删除/home所在的lv(注意mapper下面的文件名,XXX-home,XXX-root)lvremove /dev/mapper/cl-home5、拓展/root所在的

Western Blot视频详解

1、Introduction to Western Blotting Part 12、Introduction to Western Blotting Part 23、Introduction to Western Blotting Part 34、Introduction to Western Blotting Part 45、Introduction to Western Blotting Part 56、Introduction to Western Blotting Part 6

Centos7通过yum快速安装Transmission

1、打开yum.repos.dcd /etc/yum.repos.d2、安装GEEKERY REPO EPEL(中国科学技术大学提供)centos6:rpm -ivh http://h5.hcd211.top/linux/repository/epel-release-latest-6.noarch.rpmcentos7:rpm -ivh http://h5.hcd211.top/linux/repository/epel-release-latest-7.noar

Centos7安装Xware离线下载

  1. 下载Linux版本Xware1.0.31_x86_32_glibc

    下载地址:Xware1.0.31_x86_32_glibc.zip

  2. ftp工具上传到centos系统中,或者:

  3. wget http://doc.hcd211.top/zb_users/upload/2017/05/201705021493710525743119.zip
  4. 我的系统为Centos7,64位,我将Xware解压在了/home/tar中,运行Xware:

  5. ./porta    //注意要在portal所在目录运行
  6. 得到迅雷远程下载的激活码:

  7. THE ACTIVE CODE IS: purtfk
  8. http://yuancheng.xunlei.com,登陆后我的下载器添加,输入激活码即可绑定。

  9. 创建迅雷下载目录:

  10. useradd --no-create-home --user-group thunder    //创建thunder用户(不包不带有thunder目录)
    chown thunder:thunder -R /home/tar               //把tar目录权限赋予thunder 
    mkdir /home/tar/TDDownload -p                    //在tar下创建TDDownload目录
    mkdir /media/thunder/TDDownload -p               //在media下创建目录
    chown thunder:thunder -R /meida/thunder/TDDownload    //给meida下目录赋予thunder权限
    mount --bind /home/tar/TDDownload /media/thunder/TDDownload    //将tar下的下载目录挂在到media下的目录
  11. 运行Xware

  12. ./portal    //注意是在portal目录下运行才可
  13. 可以看到:

  14. THIS DEVICE HAS BOUND TO USER: *****.

附一张图片:

QQ截图20170502160903.png

未来好长,大步向前

你总会遇见几个人, 遇见几个喜欢的几个小物件,遇见一段刻骨铭心的爱情, 和一场撕心裂肺的告别。生命是一场盛大的幻觉,,我们哭着笑着就看着时间把那些多年前许过的愿望带到面前。

引物设计

PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前,PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟,包括聚合酶以及缓冲液的优化,使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样,分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说,整个PCR实验条件,基本可以模板化,而不需每做一个实验都从头开始摸条件。

然而PCR实验中,有一个环节是厂家无法帮我们优化的,那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为例,手把手教各位用最简单的方法,设计用于实时定量PCR研究基因表达水平的引物。在第二部分还会简单介绍,如何用相同的在线工具来评价引物。

(注:本文仅介绍的引物设计方法,仅适用于染料法qPCR之于基因表达定量研究,不涉及其他应用。像ORF克隆,没有特别的方法,就是老老实实在ORF一头一尾设计一对,用DNAStar lasergene等软件可以辅助设计,或者自己手动。而如果要做点突变、插入、删除,或者多片段组装,可以使用NEB相应的在线工具。)

第一部分:用Primer Blast设计引物

首先,上NCBI搜人CRTC1基因。

QQ截图20170329165757.jpg

往下拉,可以看到这个基因可能存在2种转录本。(NM开头的就是mRNA,其他暂时别管)

QQ截图20170329170131.jpg

    继续往下拉,找到各个转录本的具体信息,可以看到isoform 1和3共2个转录本。

QQ截图20170329170355.jpg

    以isoform 3为例,点击NM_001098482.1那个超链接,进入下面这个页面。

QQ截图20170329170700.jpg

    点击右方的Pick Primers,进入引物设计的Primer Blast页面。可以看到PCR Template那里已经帮你填好了。现在,其他地方暂时留空,把PCR product size的Max改成350。qPCR反应中,延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算,30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降,所以保守起见,将最大产物长度设为350 bp甚至更低比较合适。太短也不行,否则跟引物二聚体分不开,所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合适的引物,那就把这个数字往上调,最好别超过500,要不然qPCR的反应条件就得改了(其实也就改延伸时间)。

QQ截图20170329171051.jpg

    接下来,Exon junction span选项改为Primer must span an exon-exon junction。这里的意思是,至少有一条引物跨过了外显子之间的连接处。这样就算有基因组DNA污染了cDNA,也不会被扩增出来,保证定量准确。当然如果有的基因硬是没有内含子,改了这个选项就会报错。

QQ截图20170329171243.jpg

    接下来的选项不用更改。Specificity check默认打钩,帮你跑引物特异性验证。Organism已经帮你自动填了人类(9606是Homo sapien的编号,你想研究其他物种,那就在一开始搜基因的时候搜对应的物种)。最后一行,如果你把钩打上的话,就会允许引物帮你扩增其他isoform(本例中就是isoform 1)。当然,这不代表着会把所有isoform一起扩增,或者说强制一起扩增。如果需要这么做,我们需要返回前面更改一下设置。这一点第一部分的末尾注明。

QQ截图20170329171522.jpg    点击Get Primers按钮,就会帮你设计引物了。由于是在线工具,请耐心等待几十秒。有时候人多,可能需要等几分钟。

QQ截图20170329172009.jpg    很快我们就会看到这个页面,返回了10对引物。按照前面的默认条件,这些引物的退火温度都在60℃左右。

QQ截图20170329172418.jpgQQ截图20170329172636.jpg

    按照这个方法设计出来的引物,我做了那么多基因,成功率基本接近100%。这个在线工具的算法也在不断优化,按照近两三年的使用情况来看,没有遇到过失败的。(尤其是使用比较良心和稳定的试剂。在国内我是用天根,在美国是用原名biotool刚更名为bimake的试剂。好吧你说是软文我也懒得反驳,反正我就用这两家。这里也没有钦定的意思,我也用过Qiagen,Biorad和Thermo的,也能做得很好,但贵。)

    那如果要同时扩增isoform 1转录本,那怎么办呢?很简单,由于不同转录本之间同源性很强,基本上只有5’或者3’端有点差异,因此我们只需要指定引物落在所有转录本的共同区间就行了。

    回到刚开始的页面,我们可以看到另外一个转录本1。后面第4个以后的外显子(就是绿色的小竖线)是所有转录本都完全一致的。也就是说,我们只要让反向引物落在第4个外显子之后,就可以把所有2个转录本一起扩增出来了。

QQ截图20170329170131.jpg

注意:XM开头的不是我们需要的,那些是预测的转录本。

    往下拉,这一例中我们可以随便点击任何一个转录本的NM那个超链接,比如还是isoform 3,进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前,点击Highlight Sequence Features。

QQ截图20170329170700.jpg

    然后你就会看到页面的底下变成了这个模样。我们把高亮的序列设置为exon(Feature左边),并高亮第4个外显子。目测一下,这个外显子从380位碱基开始。记下这个数字。

QQ截图20170329180150.jpg

    回到上方,点击Pick Primers,并把正向引物的5’端边界设为380。注意,不是3’端边界。其他的选项,按照本文前面讲述的方法进行调整。然后点击Pick Primers按钮。

QQ截图20170329193713.jpg

    此时傲娇的程序就会跳出来抗议说,你这样会P出其他的isoform。然而这就是我们要的结果。于是把所有的钩都选上。

QQ截图20170329193907.jpg

    点击Submit,再耐心等一会,就能得到能够扩增所有isoform的引物了。

QQ截图20170329194336.jpg    我们可以看到,10个引物都是至少从第四个外显子后才出现的。

QQ截图20170329194532.jpg    如上图所示,这两个都是我们需要的!

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